EU 432-2012 NMR η HPLC

  • απο τον δρ Προκόπιο Μαγιάτη

Η βασική διαφορά ανάμεσα στις δύο μεθόδους NMR η HPLC για την ανάλυση φαινολών για τον ισχυρισμό υγείας EU 432-2012 είναι:

  • H μέθοδος NMR μετράει απευθείας τα σήματα που αναλογούν σε αριθμό ατόμων και μορίων σε ορισμένη ποσότητα δείγματος

  • Η  HPLC μετράει τα σήματα που σχετίζονται με απορρόφηση του φωτός και η οποία έμμεσα συνδέεται με των αριθμό των μορίων σε  ένα δείγμα χρησιμοποιώντας έναν αυθαίρετο παράγοντα συσχέτισης
  • Ειδικότερα στη μέθοδος NMR μπορούμε και παρατηρούμε κορυφές οι οποίες αντιστοιχούν σε συγκεκριμένα άτομα υδρογόνου ενός συγκεκριμένου μορίου. Το εμβαδό της κορυφής αναλογεί στον αριθμό των ατόμων που αντιστοιχούν στην κορυφή και συνεπώς στον αριθμό των μορίων που αντιστοιχούν σε αυτήν την κορυφή.
  • Χρησιμοποιώντας εσωτερικό πρότυπο γνωστής ποσότητας μπορούμε να συσχετίσουμε  το γνωστό αριθμό των μορίων του εσωτερικού προτύπου με το συγκεκριμένο εμβαδό της συγκεκριμένης κορυφής. Συγκρίνοντας το εμβαδό της κορυφής του εσωτερικού προτύπου με την κορυφή συγκεκριμένου φαινολικού συστατικού που θέλουμε να μετρήσουμε πετυχαίνουμε άμεση μέτρηση της ποσότητας της ουσίας που θέλουμε να μετρήσουμε.
  • Η λήψη του φάσματος NMR γίνεται με διάλυση του δείγματος σε διαλύτη πχ CDCl3 ο οποίος δεν μπορεί να αντιδράσει με καμία από τις φαινόλες που θέλουμε να μετρήσουμε και επίσης  δεν υπάρχει στατική φάση, δεν υπάρχουν αντλίες, δεν υπάρχουν λάμπες UV, δεν υπάρχουν κινητά σημεία που μπορούν να παρεμβαίνουν στην ανάλυση.

NMR example of olive oil analysis

  • Το εμβαδο της κορυφής του εσωτερικού προτύπου (IS: συριγγαλδεϋδη) αντιστοιχεί σε γνωστό αριθμό ατόμων υδρογόνου και συγκεκριμένη γνωστή ποσότητα μορίων του εσωτερικού προτύπου, αφού κάθε μόριο περιέχει ένα άτομο υδρογόνου το οποίο συντονίζεται σε συγκεκριμένη συχνότητα του αλδεϋδικού πρωτονίου της συριγγαλδεϋδης.
  • Εάν συγκρίνουμε το εμβαδό της κορυφής του IS με το εμβαδό οποιασδήποτε από τις κορυφές που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένα άτομα υδρογόνου της κάθε συγκεκριμένης ουσίας που θέλουμε να μετρήσουμε, μπορούμε απευθείας  να μετρήσουμε των αριθμό των ατόμων υδρογόνου που αντιστοιχούν σε κάθε κορυφή και συνεπώς των αριθμό των μορίων από κάθε ουσία, αφού πάλι κάθε άτομο αντιστοιχεί σε ένα μόριο.
  • Τα αποτελέσματα από την NMR ανάλυση εκφράζονται σε mg κάθε ουσίας ανά kg ελαιολάδου.
  • Η προτεινόμενη μέθοδο από το IOC για την μέτρηση των ολικών φαινολών βασίζεται σε χρωματογραφικό διαχωρισμό κάθε φαινολικού συστατικού και στην έμμεση μέτρηση της ποσότητας της κάθε ουσίας χρησιμοποιώντας την απορρόφηση στο UV από κάθε ουσία την στιγμή που η ουσία εκλούεται από την στήλη διαχωρισμού και περνά από τον θάλαμο με την λάμπα UV. Η απορρόφηση  στο UV καταγράφεται σε σχέση με τον χρόνο και η ποσότητα της κάθε ουσίας αναλογεί με το εμβαδό της κορυφής της κάθε ουσίας. Το καταγεγραμμένο γράφημα καλείται χρωματογράφημα.
  • Δεν είναι φάσμα όπως είναι στην ανάλυση NMR.  Το εμβαδό της κορυφής της κάθε ουσίας συγκρίνεται με το εμβαδό της κορυφής γνωστής ποσότητας τυροσόλης και τα αποτελέσματα εκφράζονται σαν ισοδύναμα τυροσόλης  σε mg ανά kg ελαιολάδου.
  • Το εμβαδό της κορυφή κάθε ουσίας θεωρητικά αναλογεί στον αριθμό των μορίων κάθε ουσίας αλλά το εμβαδό επίσης καθορίζεται από την ικανότητα του κάθε μορίου να απορροφά στην λάμπα UV σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος. Αυτό σημαίνει ότι αν δύο ουσίες Α και Β είναι σε μίγμα σε ίσο αριθμό μορίων αλλά η Α ουσία απορροφά στο UV 2πλάσια από την Β ουσία, το εμβαδό της κορυφής  της Α ουσίας θα είναι διπλάσιο από το εμβαδό της κορυφής της Β ουσίας. Έτσι αν οι δύο κορυφές συγκριθούν με γνωστό εμβαδό της κορυφής της τυροσόλης τότε η Α ουσία θα αντιστοιχεί σε διπλάσιο ισοδύναμο τυροσόλης σε σύγκριση με την ουσία Β παρόλο που και οι δύο βρίσκονται στην ίδια αναλογία μορίων.
  • Αυτό είναι πολύ κρίσιμο διότι όλες τα φαινολικά συστατικά του ελαιολάδου που περιέχουν το κομμάτι της υδροξυτυροσόλης (όπως η ελαιασίνη, το άγλυκο της ολευρωπεϊνης και η ελαιομισιονάλη) έχουν σχεδόν διπλάσια ικανότητα απορρόφησης στο UV σε σύγκριση με τις ουσίες που περιέχουν κομμάτι τυροσόλης (ελαιοκανθάλη, άγλυκο του λιγκστροσίδη, και ελαιοκορωνάλη).  Με αυτό το σκεπτικό τα ελαιόλαδα που περιέχουν περισσότερο παράγωγα υδροξυτυροσόλης από τυροσόλης εμφανίζονται να είναι πλουσιότερα σε ολικές φαινόλες όταν τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα τυροσόλης.
  • Η μέθοδος HPLC υπερεκτιμά το φαινολικό περιεχόμενο των ελαιολάδων που είναι πλούσια σε άγλυκο της ελευρωπαϊνης και ελαιασίνη( πχ Picual, Coratina)
  • Ενώ υποτιμά τα ελαιόλαδα που είναι πλούσια σε ελαιοκανθάλη (πχ Koroneiki, Kalamata.
  • Παρόλα αυτά αν συγκρίνουμε τα αποτελέσματα HPLC ανάμεσα σε ελαιόλαδα της  ίδιας ποικιλίας ελιάς τότε η σχετική συσχέτιση είναι γενικώς σωστή (επειδή γίνονται τα ίδια σχετικά λάθη).
  • Η μέθοδος HPLC μετρά το εμβαδό από όλες τις κορυφές που ανιχνεύονται στα 280 nm. Επομένως στο ολικό φαινολικό περιεχόμενο περιλαμβάνονται και άλλα μόρια που δεν περιλαμβάνονται στην λίστα των ουσιών που αφορούν τον ευρωπαϊκό ισχυρισμό υγείας.

ΠΧ: Λιγνάνια, φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή κτλ

  • Επίσης παλιά ελαιόλαδα υδρολύονται και παράγεται μεγάλη ποσότητα υδροξυτυροσόλης και τυροσόλης τις οποίες αναγκαστικά μετρώνται και περιλαμβάνονται στο ολικό φαινολικό περιεχόμενο. Για αυτό το λόγο το ολικό φαινολικό περιεχόμενο μετρημένο με την μέθοδο HPLC  δεν μπορεί να διαχωρίσει  τα παλιά υδρολυμένα ελαιόλαδα από τα φρέσκα και καλά διατηρημένα ελαιόλαδα.
  • Άλλα σφάλματα που συμβαίνουν κατά την ανάλυση με HPLC είναι ότι ευαίσθητες ουσίες όπως η ελαιοκανθάλη και η ελαιασίνη αλληλεπιδρούν με τους διαλύτες της κινητής φάσης όπως νερό ή μεθανόλη και μετατρέπονται σε ημιακετάλες (οι οποίες δεν υπάρχουν στο ελαιόλαδο).
  • Επίσης οι ευαίσθητες ουσίες όπως η ελαιοκανθάλη και η ελαιασίνη αλληλεπιδρούν με την στατική φάση και μπορούν προσωρινά να απορροφηθούν στην επιφάνεια της Silica και έτσι να μην επιτρέπεται να εκλουστεί και να μετρηθεί η πραγματική ποσότητα της ουσίας.
  • Τα παραπάνω προβλήματα ξεπερνιούνται χρησιμοποιώντας καμπύλες αναφοράς με καθαρές ουσίες ελαιοκανθάλης και ελαιασίνης αλλα μέχρι τώρα αυτό δεν περιλαμβάνεται στην επίσημη μέθοδο.
  • Για αυτούς τους λόγους η HPLC υποβαθμίζει υπερβολικά το πραγματικό περιεχόμενο ελαιοκανθάλης και ελαιασίνης.
  • Οι ουσίες άγλυκο της ελευρωπαϊνης και άγλυκο του λιγκστροσίδη κατά την διάρκεια της χρωματογραφίας κατά ένα μέρος ισομεριώνονται (από ανοιχτή σε κλειστή μορφή) και πάλι δεν μπορεί η HPLC να μετρήσει την πραγματική τους ποσότητα στο ελαιόλαδο. Η κλειστή μορφή υπερεκτιμάται σε σχέση με την ανοιχτή μορφή (ελαιοκορωνάλη, ελαιομισσιονάλη).
  • Για όλους αυτούς τους λόγους τα χρωματογραφήματα της HPLC γίνονται πολύ περίπλοκα διότι κάθε ουσία μετατρέπεται σε αρκετά παράγωγα ή ισομερή και συνεπώς οι κορυφές είναι αρκετά επικαλυπτόμενες και έτσι το εμβαδό της κάθε κορυφής είναι δύσκολο να μετρηθεί σωστά.
  • Η επίσημη μέθοδος HPLC δεν πρέπει να χρησιμοποιείται για την μέτρηση κάθε φαινόλης χωριστά αλλά μόνο για την μέτρηση των ολικών φαινολών.
  • Πολλά όμως εργαστήρια χρησιμοποιούν λανθασμένα την επίσημη μέθοδο HPLC-UV για την μέτρηση κάθε μίας φαινόλης εκφράζοντας τα αποτελέσματα σαν ισοδύναμα τυροσόλης.
  • Προσοχή!: Η σχετική συσχέτιση με την μέθοδο HPLC ανάμεσα σε διαφορετικά ελαιόλαδα της ίδιας ποικιλίας ελιάς είναι γενικώς σωστή αφού γίνονται τα ίδια λάθη για όλα τα συστατικά.
  • Ακολουθώντας τη γενική μέθοδο ανάλυσης πολυφαινολών του διεθνούς συμβουλίου ελαιολάδου αναλύσαμε με LCMS πρότυπη καθαρή ελαιοκανθάλη και φάνηκε ότι >80% μετατράπηκε σε artifacts (ακετάλες, ημιακετάλες-ενυδατωμένες/μεθυλιωμένες μορφές) λόγω της αντίδρασης με τη μεθανόλη και το νερό που χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση και τη χρωματογραφία

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

  • Το μεγάλο πρόβλημα προκύπτει όταν οι απόλυτες μετρήσεις της μεθόδου NMR συγκρίνονται  με τα σχετικά αποτελέσματα της μεθόδου HPLC.
  • Σε αυτήν την περίπτωση στην κορυφή όλων των προηγούμενων προβλημάτων υπάρχει μια αρκετά διαδεδομένη απλούστευση : Η τυροσόλη έχει μοριακό βάρος 138 mg/mmol, ενώ η ελαιοκανθάλη έχει MB 304 mg/mmol, ελαιασίνη 320 mg/mmol κτλ. Έτσι όταν μετράμε  ένα ελαιόλαδο με τη μέθοδο NMR που περιέχει 304 mg/kg ελαιοκανθάλη, σημαίνει ότι περιέχει 1 mmol/kg ελαιοκανθάλης. Εάν υποθέσουμε ότι το ένα μόριο ελαιοκανθάλης απορροφά την ίδια ποσότητα φωτός όπως ένα μόριο τυροσόλης (το οποίο δεν είναι ακριβώς σωστό) τότε αν εκφράσουμε τα αποτελέσματα ως ισοδύναμα τυροσόλης , τότε αυτή η ποσότητα το 1 mmolαντιστοιχεί σε 138 mg/kg τυροσόλης.
  • Προκαλεί μεγάλη έκπληξη όταν χημικοί προσπαθούν να συγκρίνουν απόλυτες μετρήσεις (όπως NMR) με σχετικές μετρήσεις εκφρασμένες σε ισοδύναμα (όπως στην HPLC), χωρίς να εξηγούν αυτήν την βασική διαφορά. Απλά και μόνο η διαφορά στο μοριακό βάρος από μόνη της θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί οι τιμές με την μέθοδο HPLC είναι γενικότερα  πολύ μικρότερες από τις τιμές της μεθόδου NMR. Εάν εκτός από αυτό το πρόβλημα προσθέσουμε και την υποτίμηση της ελαιοκανθάλης και της ελαιασίνης με την HPLC εξαιτίας της αλληλεπίδρασης με την κινητή και στατική φάση καθώς και την μετατροπή σε πολλά artifactsτότε είναι φανερό ότι η μέθοδος HPLC είναι  εντελώς ακατάλληλη και παραπλανητική για την μέτρηση ανεξαρτήτων φαινολικών συστατικών και γίνεται αντιληπτό γιατί δίνει μικρότερες αριθμητικές τιμές  σε σύγκριση  με το NMR.
  • Για όλους αυτούς τους λόγους η σύγκριση ανάμεσα σε διαφορετικά ελαιόλαδα σε ότι αφορά το ολικό φαινολικό περιεχόμενο πρέπει να γίνεται μόνο με την ίδια μέθοδο. Ειδικότερα η μέτρηση ανεξαρτήτων φαινολικών συστατικών είναι αξιόπιστη μόνο με την μέτρηση τους με την μέθοδο NMR (ή κατάλληλη καλιμπραρισμένη LC-MS) αλλά όχι με HPLC-UV με ισοδύναμα τυροσόλης.
  • Πρέπει να σημειωθεί επίσης ότι Ευρωπαϊκός  Ισχυρισμός υγείας αναφέρεται στην μέτρηση κάθε ουσίας χωριστά και δεν αναφέρει πουθενά για ισοδύναμα τυροσόλης.